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Western blotting實驗步驟

1．蛋白質的樣品制備：

取心肌組織50mg，待組織塊自行溶解，用濾紙吸去其表面水分，將組織塊放入玻璃勻漿器球狀部位，用組織剪盡量將其剪碎，將剪碎的心肌組織放入玻璃勻漿器的桿狀部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌組織的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），將玻璃勻漿器插入冰中，勻漿約30分鐘。

將心肌組織勻漿轉移到離心管中，4℃12000g離心5分鐘，收集上清（如有粘稠物進一步用超聲處理），樣品分裝凍存于-20℃備用。

2 .測定蛋白濃度：

2.1 按50：1配置BCA工作液。

2.2 10ulC液（蛋白標準）+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白標準液。

2.3 分別以0、1、2、4、8、12、16、20ul將蛋白標準液加入96孔板的第1~8標準孔中，在其他樣品孔中加入10ul待測樣品。

2.4 分別加PBS定容至20ul。

2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室溫放置2小時。

2.6 用酶標儀測定蛋白濃度：測定A562，依標準曲線算出蛋白濃度。

3  SDS-PAGE電泳：

3.1 制 膠: 按比例配制分離膠，緩緩地搖動溶液，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水，以阻止氧氣進入凝膠溶液中，靜置40min。同前按比例配制濃縮膠，但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續系統中下層分離膠上的水分，連續平穩的注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜制60min以上以保證*聚合。

3.2 預電泳： 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預電泳20-30min。（目的是清除凝膠內的雜質， 疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通）。

3.3 樣品準備：首先計算上樣體積，然后按樣品：上樣buffer=4：1的比例加入上樣bufer混勻，沸水煮10分鐘，冰上5分鐘。

3.4 加 樣： 預電泳后依次加入標準品（Marker）和待分析樣品。（加樣時間要盡量短，以免樣品擴散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應。每個泳道加5ul。

3.5 電 泳： 加樣完畢，選擇80V恒壓進行電泳，電泳直至溴酚藍染料前沿到達兩膠交界處（一般約20分鐘），更換至100V恒壓電泳，電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳（一般約為1小時20分鐘）。

4．轉 膜：

4.1 切膠：將電泳完畢的膠完整的放在盛有電轉液的玻璃皿中，將目的蛋白所在區域切下來，測量其長寬，并記錄。

4.2 剪膜和濾紙：按膠的尺寸剪膜和濾紙（濾紙長寬較凝膠小0.5~1mm，PVDF膜長寬較凝膠大0.5~1mm），濾紙浸入盛有電轉液的玻璃皿中10秒鐘，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒鐘，然后將兩者都放入盛有去離子水的玻璃皿中3分鐘，進一步放入盛有電轉液的玻璃皿中3分鐘。

4.3 向電轉槽中倒入部分電轉液，將海綿浸入。按如下順序制作“三明治”（注意避免兩邊濾紙相互接觸，以免發生短路）。從正極到負極按如下順序排列：正極-海綿-雙層濾紙-PVDF膜-凝膠-雙層濾紙-海綿-負極。（其中不能留有氣泡）卡緊轉膜板，電轉槽中倒滿電轉液，將轉膜板浸入電轉槽中，注意正負極要正確。插上電源，設定恒流20mA轉膜，4℃冰箱中。

5、膜的封閉: 用TBST液洗滌印跡膜10分鐘x2次。放入5%脫脂奶粉封閉液內，搖床震動，70轉/分鐘，室溫封閉1小時30分鐘。

6、一抗孵育：

6.1 配制一抗：按相應抗體的效價加入一抗稀釋液，一抗稀釋液按0.05% TBST（ml）：脫脂奶粉（g）=20：1配制。

6.2一抗孵育：將封閉后的膜放入雜交袋中，加入一抗約1ml，室溫搖床（70轉/分鐘）孵育1小時30分鐘。

6.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次。

7、二抗孵育：

7.1 配制二抗：按相應抗體的效價加入二抗稀釋液，二抗稀釋液按0.05%TBST（ml）：脫脂奶粉（g）=20：1配制。

7.2 二抗孵育：將一抗孵育后的膜放入二抗中，室溫搖床（70轉/分鐘）孵育1小時30分鐘。

7.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次。

8、ECL顯色

8.1 配制ECL工作液：在避光的容器中按A液：B液=1：1的比例配制。

8.2 按膜：工作液=10cm2：1ml的比例將ECL工作液覆蓋到膜表面，放置1~2分鐘后在凝膠成像系統中觀察、拍照。

我們的實驗過程如下：

 電泳： SDS-PAGE; 預電泳 恒壓55 V 20 min，上樣25 ul, 恒壓55 V 40 min左右，當樣品至分離膠面時，恒壓75 V，到考馬斯亮藍至底部，停止電泳。

轉印：制作轉印三明治，150 mA。8%-90 min,10%-80min,12%-50min。中止轉印,有條件可以利用麗春紅檢測總蛋白轉印是否成功。

封閉：將轉印膜取出，用去離子水清洗，TBST洗一次5 Min后，加入5%的脫脂牛奶封閉，于28度封閉2小時。(注意封閉液，一抗稀釋液，二抗稀釋液均含有脫脂牛奶，可以配成含0.01%硫柳汞的溶液以免牛奶變質)

 洗膜1次，10 min，

 一抗孵育：一抗濃度1：100（2.5%牛奶抗體稀釋液），4度孵育隔天

 洗膜4次，每次15 min

 二抗孵育：二抗濃度1：3000（2.5%牛奶抗體稀釋液），28度孵育1.5-2 H

 洗膜4次，每次15 min（建議洗膜完畢后，不要立刻顯色，靜置或者輕搖1.5h-2h后再顯色）

顯色：注意顯色時間的控制和曝光時間的控制

祝您工作順利，實驗順利！